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25羥基維生素D臨床檢測

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25羥基維生素D臨床檢測

2020-06-27 08:44:49

25羥基維生素D臨床檢測

近年來,應用液相色譜-串聯質譜法進行臨床檢測的項目當中,維生素D的檢測可算得上是最火熱的項目了。據調查顯示,國內維生素D的臨床檢測逐年遞增。國內的一些第三方檢測中心例如金域醫學,其每年應用液質聯用儀檢測的數量早已突破30萬例!凱萊普精準醫療檢測實驗室也是達到了每年將近20萬人次檢測。還有一些三甲醫院也陸陸續續開展了維生素D的質譜檢測,下面為大家介紹下神奇的維生素D。

維生素D的發現之旅


維生素D(vitamin D )為固醇類衍生物,目前被認為也是一種類固醇激素,維生素D家族成員中最重要的成員是VD2(麥角鈣化醇)和VD3(膽鈣化醇)。維生素D的發現是人們與佝僂癥抗爭的結果。早在1824年,就有人發現魚肝油可在治療佝僂病中起重要作用。1918年,英國的梅蘭比爵士證實佝僂病是一種營養缺乏癥。但他誤認為是缺乏維生素A所致。1930是維生素D年,Gottingen大學的A.Windaus教授首先確定了維生素D的化學結構,1932年經過紫外線照射麥角固醇而得到的維生素D2的化學特性被闡明。維生素D3的化學特性直到1936年才被確定。

其實除了佝僂病,維生素D缺乏甚至與癌癥、糖尿病、軟骨病、免疫系統疾病、精神分裂癥等息息相關。醫學分析表明,將維生素D攝取量增至1000 IU /d 可能降低結腸癌和乳腺癌的患病幾率50%。男性攝入維生素D 400 IU /d 可大幅降低患多種癌癥的幾率,包括胰腺癌、食道癌和非霍奇金淋巴瘤。孩子在生命的第一年期間每天攝入2000 IU的維生素D,在30年隨訪期間I型糖尿病的風險降低80%。美國科學家一項新研究表明,維生素D不僅能提高骨強度,還可以防止蛀牙。據報道,全球居然有近10 億人維生素D不足或缺乏!

那如何判斷維生素D在人體內缺乏與過量呢?

維生素D在人體內的最優濃度水平尚有爭議,但是大部分科學家認為濃度水平低于20μg/L(50nmol/L)定義為維生素缺乏。濃度水平在21~29μg/L(52~72nmol/L)水平可以被認為指示維生素D相對缺乏,大于150μg/L(374nmol/L)則可觀察到維生素D中毒。也就是說維生素D的水平在30~150μg/L則為正常水平。

維生素D對人體既然如此重要,那它在人體中是如何吸收和作用的呢?下面我們可以從維生素D代謝途徑進行了解。


維生素D體內生理過程


25羥基維生素D臨床檢測(圖1)


圖1 維生素D體內代謝過程



維生素D獲取途徑

25羥基維生素D臨床檢測(圖2)

由此可見,要想使人體中的維生素D維持在正常水平,就需要通過食物攝入和適量的陽光浴。

常見富含維生素D的食物推薦:海魚和魚卵、動物肝臟、蛋黃、奶油和奶酪等。

哪些人需要補充維生素D?

都市中,特別是濃煙污染地區的人應該攝取更多的維生素D。 寫字樓職員、夜間工作者或因為服裝、生活工作方式而不能充分得到陽光的人要特別注意在飲食中增加維生素D。 素食者、嬰幼兒和老人需要補充維生素D。

好了,普及了那么多有關維生素D的知識,那臨床檢測維生素D都有什么方法呢?


維生素D的檢測

1.放射免疫法(radioimmunoassav, RIA)
優點:初始投入成本低、高自動化、重現性好; 
缺點:特異性不高,不能準確測定25羥基維生素D2的含量;測試樣本成本較高;回收率較差;

2.酶聯免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)或化學發光免疫法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)
優點:檢測速度快、費用低廉、儀器簡單易攜、靈敏度高和選擇性強等;
缺點:特異性和靈敏度不高、操作繁瑣費時;

3.高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)
優點:分離效果好、速度快等; 
缺點:基質效應嚴重、不能很好的定性等;

4.液相色譜串聯質譜法(Liquid chromatography –tandem mass spectrometry method, LC-MS/MS)
優點:國際上維生素D檢測的金標準!具有靈敏度高、專屬性強、能同時監測25-羥維生素D2和25-羥維生素D3;
缺點:初始投入成本高、對操作人員技術要求高;

同時檢測25(OH)D2和25(OH)D3的意義何在?

25(OH)D是機體維生素D的主要儲存形式,占總量的95%以上。由于其半衰期長(2~3周),并且不受血鈣和甲狀旁腺素水平的影響,因此被公認為是客觀評價維生素D營養狀況的最佳指標。

2010年,來自臨床和實驗室的專家們共同推薦25(OH)D的檢測方法應能同時檢測出25(OH)D2和25(OH)D3,以保證來源于植物或動物的維生素D補充均能夠被檢測出。因此,臨床實驗室需要選擇一種可以同時識別2種25(OH)D形式的檢測方法。


維生素檢測的標準化進程


目前,由于維生素D檢測的標準化工作剛剛起步,各種檢測方法間存在著明顯的結果差異,尤其是商業化方法以及不同實驗室的自建方法。研究發現檢測結果存在差異的主要原因是檢測抗體的特異性差異、解離結合蛋白的方法差異和嗜異性抗體的干擾。

為了解決維生素D檢測面臨的實際問題,提供給臨床更準確的信息,保障患者的醫療安全,美國國立衛生研究院(the National Institutes of Health,NIH)營養健康辦公室(the Office of Dietary Supplements,ODS)與美國疾病預防控制中心(the Center for Disease Control and Prevention,CDC)、美國國家標準和技術研究院(the National Institute of Standards and Technology,NIST)和比利時根特大學一同合作,啟動了維生素D標準計劃(The Vitamin D Standardization Program, VDSP)。



標準化的實現必須具備3個關鍵要素


參考測量體系的建立、溯源性的建立和終端用戶的檢測性能保證。VDSP對于25(OH)D標準化的實現制定了3個具體步驟,見圖2。

25羥基維生素D臨床檢測(圖3)


圖2 VDSP實驗步驟


注:PT為能力驗證(proficiency testing);EQA為室間質量評價(external quality assessment);SRM為標準參考物質(standard reference material);CAP為美國病理學家協會(the College of American Pathologists);DEQAS為維生素D室間質量評價計劃(the Vitamin D External Quality Assessment Scheme);VitDQAP為維生素D代謝物質量保證項目(the Vitamin D Metabolites Quality Assurance Program)

接下來我把VDSP參考測量體系的組成部分中參考測量程序和性能驗證程序詳細介紹下:


25羥基維生素D臨床檢測(圖4)

圖3 VDSP參考測量體系的組成部分


參考測量程序:NIST和比利時根特大學先后建立了同位素稀釋- 液相串聯質譜法(isotope-diluted-liquid chromatography tandemmass spectrometry,ID-LC-MS/MS)檢測25(OH)D[包括25(OH)D2、25(OH)D3和3-epi-25(OH)D]的參考方法,并被國際標準化組織認證并納入檢驗醫學溯源性聯合委員會(the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine,JCTLM)數據庫中。


25羥基維生素D臨床檢測(圖5)


圖4 維生素D標準認證程序


性能驗證程序:為保障25(OH)D檢測結果的準確性,2010年NIH-ODS與CDC合作建立了維生素D標準化認證程序,并號召所有的生產廠商和實驗室積極參與。該認證程序分2個階段進行(見圖4),首季度發放40份參考方法(JCTLM認證)定值的血清用于校準,保證廠商或實驗室自建方法的結果具有溯源性。隨后,每季度發放10份盲樣樣本用于精密度及準確度評估。參加者連續4次的調查結果符合認證程序的要求即頒發認可證書,有效期為1年。重新認證是1年1次,維生素D的性能驗證標準是平均偏差≤5%,不精密度≤10%。

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